同源重組實驗

簡要描述：同源重組實驗是一種依賴DNA序列相似性（同源臂）的精準基因編輯技術，通過外源載體與宿主基因組間的序列交換實現(xiàn)靶向修飾。

更新時間：2025-07-17
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一、定義與分子機制

同源重組是一種依賴DNA序列相似性（同源臂）的精準基因編輯技術，通過外源載體與宿主基因組間的序列交換實現(xiàn)靶向修飾。其核心機制包括：

同源臂介導的精準定位

外源載體兩端設計≥1 kb的同源臂（與靶基因側(cè)翼序列一致），引導載體與基因組特異性結(jié)合（避免隨機插入）。

DNA斷裂修復與交換

內(nèi)源核酸酶（如Cas9）或自發(fā)損傷誘導雙鏈斷裂（DSB） → 細胞啟動同源定向修復（HDR） → 以載體為模板合成新鏈，實現(xiàn)基因替換/插入。

關鍵分子參與者

RecA/Rad51：介導DNA鏈配對與交換
BRCA1/2：調(diào)控修復路徑選擇（HR vs. NHEJ）

生物學意義：HR是wei一能實現(xiàn)單堿基至大片段精準替換的自然修復機制，區(qū)別于易出錯的非同源末端連接（NHEJ）。

二、技術流程與關鍵步驟

1. 載體設計策略

元件	功能	案例
長同源臂	提升重組效率（1-10 kb）	小鼠基因敲除常用3 kb臂
正篩選標記	新霉su抗性（Neo^R）等，篩選重組細胞	中的"Selection"標記
負篩選標記	HSV-TK（更昔luo韋敏感），淘汰隨機插入細胞	中的Gancyclovir反選
條件性刪除系統(tǒng)	Cre/loxP或FLP/FRT，移除篩選標記	的LOXP重組

2. 細胞工程化改造

胚胎干細胞（ESC）打靶：

電穿孔導入線性化載體 → G418篩選陽性克隆
PCR/Southern驗證重組位點（避免隨機整合）

CRISPR-HR聯(lián)用：

Cas9切割靶位點 → 同步提供HR模板（效率提升50倍）

3. 動物模型構(gòu)建流程

注：傳統(tǒng)ESC/HR流程需6-12個月，CRISPR-HR可縮短至3個月。

三、應用場景與突破案例

1. 疾病模型構(gòu)建

模型類型	技術方案	疾病研究價值
基因敲除小鼠	HR替換致病基因為終止子	囊性纖維化、癌癥機制研究
點突變模型	HR引入特定SNP（如APOE4）	阿爾茨海默癥藥物篩選
人源化模型	HR插入人類基因片段（如IL-2）	免yi治療評估

2. 生物醫(yī)藥生產(chǎn)

治療性蛋白載體：

HR將人抗凝xue酶III基因插入山羊β-酪蛋白位點 → 乳汁中表達藥用蛋白（產(chǎn)量>1g/L）

基因治療修復：

HR修正β-珠蛋白突變 → 治療β-地中海貧血（臨床前階段）

3. 合成生物學

染色體工程：

Cre/loxP介導大片段重組 → 構(gòu)建環(huán)形人工染色體（中的MI系統(tǒng)）

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同源重組實驗

一、定義與分子機制

二、技術流程與關鍵步驟

1. 載體設計策略

2. 細胞工程化改造

3. 動物模型構(gòu)建流程

三、應用場景與突破案例

1. 疾病模型構(gòu)建

2. 生物醫(yī)藥生產(chǎn)

3. 合成生物學

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三、應用場景與突破案例